エクソン - 雲南ATMヒーター株式会社

Scientific Reports volume 6、記事番号: 18741 (2016) この記事を引用

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ATM は、DNA 損傷応答 (DDR) 経路の重要な頂端キナーゼをコードする重要な癌感受性遺伝子です。われわれは、ATMにおける重要なナンセンス媒介RNA減衰スイッチエクソン（NSE）が、U2AF、PUF60およびhnRNPA1によって抑制されていることを示す。 NSE の活性化はハプロタイプ特異的であり、がんリスクの高い集団で優勢である NSE 3' スプライス部位 (3'ss) の rs609261 のシトシンによって最も促進されました。白血病ではNSEレベルの調節が解除され、U2AF35残基34の正体によって影響を受けた。また、隣接する偽エクソンの競合を利用してNSEレベルを調節するスプライススイッチングオリゴヌクレオチド（SSO）も同定した。 ATMシグナル伝達経路におけるU2AFによって調節されるエクソンの使用は、MRN/ATM-CHEK2-CDC25-cdc2/cyclin-B軸を中心とし、癌関連遺伝子融合および染色体転座に関与する転写物に優先的に関与していた。これらの結果は、3’ss制御と二本鎖DNA切断に対するATM依存性応答との間の重要な関連性を明らかにし、イントロン変異体の機能的可塑性を実証し、遺伝子発現を修飾するために擬似3’ssを標的とするイントロンSSOの多用途性を例示する。

イントロンは、スプライセオソームと呼ばれる大きくて非常に動的な RNA タンパク質複合体によって除去されます。この複合体は、一次転写物、核内低分子 RNA (snRNA)、および多数のタンパク質間の複雑な相互作用を調整します 1。スプライセオソームは、U1 snRNA による 5' スプライス部位 (5'ss) または U2 補助因子の結合を含む U2 経路 1,2 による 3'ss の認識から始まり、各イントロン上で秩序ある方法でアドホックに組み立てられます ( U2AF）を 3'ss 領域に結合させて、分岐点配列（BPS）の U2 認識を促進します3。 U2AF は、ポリピリミジントラクト (PPT) に結合する U2AF2 にコードされた 65 kD サブユニット (U2AF65) と、3' で高度に保存された AG ジヌクレオチドと相互作用する U2AF1 にコードされた 35 kD サブユニット (U2AF35) で構成される安定なヘテロ二量体です。 ss と U2AF65 結合を安定化します 4。 BPS/PPT ユニットと 3'ss/5'ss に加えて、正確なスプライシングには、イントロンまたはエキソンのスプライシングエンハンサーまたはサイレンサーとして知られる、スプライス部位認識を活性化または抑制する補助配列または構造が必要です。これらの要素により、高等真核生物のゲノム内にある膨大な過剰の潜在的または偽部位の中から、本物のスプライス部位を認識できるようになります。これらの部位は、同様の配列を持ちますが、本物の部位よりも数が桁違いに多くなります5。それらは多くの場合調節機能を持っていますが6、その抑制の分子機構はほとんど理解されていません。

エクソーム配列決定研究により、U2AF1/U2AF2、およびSF3B1、ZRSR2、SF1、SF3A1、PRPF40B、およびSRSF2を含むがん細胞の3'ss認識に関与する他の遺伝子における体細胞変異の限定されたパターンが明らかになった（7で総説）。これらの遺伝子は、スプライセオソーム構築中に相互作用することが多い産物をコードし 8、9、10、がん関連変異の高度な相互排他性を示し 7、これは共通の発がん経路の存在を示唆しています。これらの変異を有する白血病のトランスクリプトームプロファイリングでは、mRNA前駆体のスプライシングにおける多数の変化が検出された7が、これらの標的が治療調節に大いに期待されているにもかかわらず、特定のRNAプロセシング欠陥とがんの発症または進行との間の重要な関連性は依然として不明瞭なままである。さらに、これらの細胞における高度に制限された突然変異パターンが、発癌特性を伴う限られた明確に定義された一連の RNA プロセシング欠陥と関連していない理由は不明でした。さらに、悪性形質転換において重要な役割を果たすDDR遺伝子におけるエクソンの使用は、3'ssプロセシング因子を欠く細胞において完全には特徴づけられておらず、それらの活性化に影響を与える天然のDNA変異体も不明である。

TAG>AAG>GAG hierarchy of exon inclusion levels at the 3′ss consensus15. To confirm that the NSE usage is allele-specific, we examined splicing of two reporter constructs that contained C or T at this position following transient transfections into HEK293 cells (Fig. 2b). As expected, the T construct yielded lower NSE inclusion than the C reporter, both in untreated cells and cells individually depleted of each U2AF subunit (Fig. 2c)./p>G13. We noticed that this mutation activated the NSE 3′ss while repressing its 5’ss and promoting a downstream 5’ss instead, introducing a 112-nt cryptic exon in the mRNA13. We also noticed that within this exon, there was a strong 3′ss consensus preceded by optimal BPS/PPT motifs, which may bind U2AF and activate a smaller, 24-nt pseudoexon (termed PE; Fig. 4a). Examination of published RNA crosslinking/immunoprecipitation data20 in ATM showed U2AF65 binding upstream and downstream of NSE and upstream of PE, suggesting that NSE activation may be controlled by competition between partially productive spliceosomes assembled at the PE 3′ss and the NSE 3′ss. The two 3′ss are conserved in mammals and are separated by a distance smaller than the minimal intron size, sterically preventing simultaneous recognition of NSE and PE (Fig. 4a). Deletion of the PE PPT/3′ss introduced in the C minigene, which should alleviate NSE repression through diminished U2AF binding to PE, increased NSE inclusion (Fig. 4b), in agreement with the 3′ss competition. This deletion also induced retention of the intron that separates NSE and PE, mimicking the splicing pattern of the A-T mutation IVS28-159A >G. Increasing the intron length from 59 to 79 nt, thereby overcoming a steric hindrance imposed by the insufficient distance between the two pseudo-3′ss, also improved NSE inclusion and diminished the intron retention (Fig. 4b)./p>G substitution13. In this A-T case, both NSE and PE were included in the ATM mRNA together with the intervening sequence. Canonical and aberrant transcripts are denoted by dotted lines above and below the pre-mRNA. Middle panel shows RNA-Seq read densities for NSE in cells depleted of both U2AF35 isoforms (ab-) together with U2AF65 tags/high-confidence binding sites (horizontal lines/rectangles) identified by crosslinking and immunoprecipitation20. The 100 basewise vertebrate conservation by Phylop (100 VC) is at the bottom. The lower panel shows mutations (in red and underlined) introduced in the C-minigene. (b) Splicing pattern of wildtype and mutated C minigenes. Mutations are at the bottom of panel (a); RNA products are shown schematically to the right. The largest product produced by clone PE delPPT/AG includes the shortened pseudointron. (c) Splicing pattern of C minigenes mutated in NSE (lanes 2, 3, 7 and 8) or PE (lanes 4, 5, 9 and 10) in (mock)-depleted HEK293 cells. Mutations are at the bottom; their sequences are in Table S2. Spliced products are schematically shown to the right. A hairpin symbol above PE denotes the MIR stem-loop insertion; cr3’ss, a cryptic 3’ss activation 7 nt downstream of the authentic NSE 3’ss. (d,e) SSO-induced pseudoexon switching. Transfected minigenes are shown at the top, spliced products to the right and SSOs at the bottom. SSO sequences are in Table S1. Final concentration of SSOs shown in panels (d–g) was 3, 10 and 30 nM. (f) PE SSOs induced NSE skipping. (g) SSOs targeting a sequence that activates NSE upon deletion (PEdelPPT/AG; panel a and b) inhibit PE. (h) NSE activation is haplotype-dependent. Minigene haplotypes at the indicated variants are at the bottom. Columns represent mean NSE inclusion, error bars are SDs, asterisks denote statistically significant differences as in Fig. 1b./p>TG > TA./p>

G62, despite targeting U2AF binding sites (Fig. 4a). This suggests that the morpholino blocked access to structures or motifs that are not responsible for exon activation, but exon repression, in agreement with our finding (Fig. 1a–c). Thus, administration of antisense-based RNA processing activators or inhibitors that target or avoid binding sites of splicing factors in introns could be exploited therapeutically to shape beneficial or detrimental consequences of NMD in cancer cells./p>